|
|
Příprava a charakterizace katalytické domény lidské proteinkinasy ASK1.
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1) patří do rodiny mitogeny aktivovaných proteinkinas kinas kinas (tzv. MAP3K) a hraje důležitou roli v imunitních a stresových odpovědích. Vzhledem k souvislosti mezi její zvýšenou aktivitou a rozvojem nemocí jako např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je tato bílkovina perspektivní cíl pro vývoj léčiv. Celý enzym se skládá z 1374 aminokyselinových zbytků (lidská ASK1), ale katalyticky aktivní je pouze Ser/Thr kinasová doména nacházející se přibližně uprostřed molekuly. Aktivita ASK1 je regulována prostřednictvím interakcí s různými proteiny včetně proteinu 14-3-3. Tento protein se váže na fosforylovaný serinový zbytek ASK1 v pozici 966 na C-konci katalytické domény. Tato vazebná interakce má za následek inhibici ASK1 prostřednictvím zatím neznámého mechanismu. Při stresovém signálu, nejčastěji při oxidativním stresu, se ASK1 na Ser966 defosforyluje a protein 14-3-3 disociuje. Rozpad komplexu ASK1:14-3-3 je jedním z dějů, které vedou k aktivaci ASK1. Cílem této práce byla příprava komplexu katalytické domény ASK1 s proteinem 14-3-3 pro následné studium interakcí těchto dvou proteinů. Oba proteiny byly úspěšně exprimovány v buňkách E. coli a purifikovány. Dále byly připraveny i různé mutantní formy obou těchto...
|
|
|
Studium interakcí ASK1 kinasy s thioredoxinem.
Koláčková, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
MAP kinasová signalizační kaskáda hraje důležitou roli při vzniku buněčných odpovědí na různé stresové podněty z vnějšího prostředí. Tato signalizační kaskáda je třístupňová: MAP kinasy kinasy kinasy (MAP3K) fosforylací aktivují MAP kinasy kinasy (MAP2K) a ty následně fosforylují a tím aktivují MAP kinasy (MAPK), čímž regulují spoustu buněčných funkcí jako je apoptosa, buněčné dělení či morfogenese. Jednou z důležitých MAP3K je proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1), která je důležitým regulátorem imunitních a stresových buněčných odpovědí. Vzhledem k tomu, že zvýšená aktivita ASK1 souvisí s rozvojem závažných onemocnění, jako jsou např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je ASK1 zajímavým cílem ve farmacii při vývoji nových léčiv. Lidská ASK1 sestává z 1374 aminokyselin a dělí se na tři domény: centrální Ser/Thr katalytickou doménu a dvě coiled-coil domény, z nichž první se nachází na N- a druhá na C-konci molekuly této proteinkinasy. ASK1 je regulována pomocí svých vazebných partnerů, mezi které patří také malý celulární redoxní protein thioredoxin (Trx-1), který se váže na N-terminální část ASK1. Trx-1 je silným antioxidantem a chrání tak buňky před toxickými podněty z okolí. Mechanismus regulace aktivity ASK1 pomocí Trx-1 je jedním z nejvíce...
|
|
|
Charakterizace vybraných vlastností modelových zástupců hemových senzorových proteinů
Fojtík, Lukáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Svášková, Dagmar (oponent)
Hemové senzorové proteiny představují čtvrtou skupinu hemoproteinů. V této skupině hemoproteinů slouží hem jako signální molekula. Disociace a asociace hemu u proteinů detekujících hem má vliv na regulaci fyziologických procesů např. regulace enzymové aktivity nebo genové exprese. V předkládané bakalářské práci jsou shrnuty dosavadní poznatky o vybraných zástupcích hlavně ze skupiny eukaryotických hemových senzorových proteinů publikované v odborných časopisech. V experimentální části této bakalářské práce jsme se zaměřili na přípravu rekombinantního proteinu, inhibitoru regulovaného hemem (HRI) a jeho proteinového substrátu, alfa podjednotky eukaryotického translačního iniciačního faktoru 2 (eIF2α). Nejprve byly připraveny, posléze amplifikovány a následně izolovány plasmidy nesoucí buď gen pro HRI nebo pro eIF2α. Následně byly dané proteiny připraveny heterologní expresí v bakteriálních buňkách E. coli BL-21(DE3) a celý proces zakončila jejich purifikace. Získali jsme finální preparát HRI o koncentraci 7,7 µM a celkovém objemu 400 µl a 60% homogenitě a finální preparát eIF2α o koncentraci 51,3 µM a celkovém objemu 400 µl a 80% homogenitě. Pilotní charakterizace obou získaných preparátů s ohledem na jejich teplotní stabilitu, přinesla důležité informace nezbytné pro správné uchovávání proteinů...
|
|
|
Úloha protein-proteinových interakcí v regulaci signálních proteinů a enzymů
Košek, Dalibor ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Karpenko, Vladimír (oponent) ; Pompach, Petr (oponent)
CZ Mezi všemi způsoby regulace signalizace mají protein-proteinové interakce přednostní postavení. Jejich studium v různých podmínkách je logickým a důležitým krokem v pochopení molekulárního mechanismu funkcí jednotlivých regulačních procesů. Tato práce je zaměřena na studium tří takových procesů: ASK1 proteinkinasa, důležitý iniciátor proapoptotických dějů, je za fyziologických podmínek udržována v neaktivním stavu v komplexu s proteinem 14-3-3 a TRX1. Za podmínek oxidačního stresu však tyto proteiny disociují a proteinkinasa se stává aktivní. Dalším procesem je interakce proteinu 14-3-3 s fosducinem a studium jeho úlohy v negativní regulaci G proteinové signalizace v rámci biochemie zraku. Třetí proces je aktivace Nth1 prostřednictvím interakce s Bmh1 a vápníkových kationů. Práce si klade za cíl pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména bodové mutageneze, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření a fluorescenční spektroskopie přispět k objasnění strukturní podstaty výše popsaných dějů a vysvětlit úlohu protein-proteinových interakcí v jejich regulaci. Na základě výsledků získaných těmito metodami byly zjištěny strukturní informace o tvaru a stechiometrii komplexů TRX1 i proteinu 14-3-3 s odpovídajícími vazebnými doménami ASK1 včetně jejich...
|
|
|
Studium interakcí ASK1 kinasy s thioredoxinem.
Koláčková, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
MAP kinasová signalizační kaskáda hraje důležitou roli při vzniku buněčných odpovědí na různé stresové podněty z vnějšího prostředí. Tato signalizační kaskáda je třístupňová: MAP kinasy kinasy kinasy (MAP3K) fosforylací aktivují MAP kinasy kinasy (MAP2K) a ty následně fosforylují a tím aktivují MAP kinasy (MAPK), čímž regulují spoustu buněčných funkcí jako je apoptosa, buněčné dělení či morfogenese. Jednou z důležitých MAP3K je proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1), která je důležitým regulátorem imunitních a stresových buněčných odpovědí. Vzhledem k tomu, že zvýšená aktivita ASK1 souvisí s rozvojem závažných onemocnění, jako jsou např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je ASK1 zajímavým cílem ve farmacii při vývoji nových léčiv. Lidská ASK1 sestává z 1374 aminokyselin a dělí se na tři domény: centrální Ser/Thr katalytickou doménu a dvě coiled-coil domény, z nichž první se nachází na N- a druhá na C-konci molekuly této proteinkinasy. ASK1 je regulována pomocí svých vazebných partnerů, mezi které patří také malý celulární redoxní protein thioredoxin (Trx-1), který se váže na N-terminální část ASK1. Trx-1 je silným antioxidantem a chrání tak buňky před toxickými podněty z okolí. Mechanismus regulace aktivity ASK1 pomocí Trx-1 je jedním z nejvíce...
|
|
|
Příprava a charakterizace katalytické domény lidské proteinkinasy ASK1.
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1) patří do rodiny mitogeny aktivovaných proteinkinas kinas kinas (tzv. MAP3K) a hraje důležitou roli v imunitních a stresových odpovědích. Vzhledem k souvislosti mezi její zvýšenou aktivitou a rozvojem nemocí jako např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je tato bílkovina perspektivní cíl pro vývoj léčiv. Celý enzym se skládá z 1374 aminokyselinových zbytků (lidská ASK1), ale katalyticky aktivní je pouze Ser/Thr kinasová doména nacházející se přibližně uprostřed molekuly. Aktivita ASK1 je regulována prostřednictvím interakcí s různými proteiny včetně proteinu 14-3-3. Tento protein se váže na fosforylovaný serinový zbytek ASK1 v pozici 966 na C-konci katalytické domény. Tato vazebná interakce má za následek inhibici ASK1 prostřednictvím zatím neznámého mechanismu. Při stresovém signálu, nejčastěji při oxidativním stresu, se ASK1 na Ser966 defosforyluje a protein 14-3-3 disociuje. Rozpad komplexu ASK1:14-3-3 je jedním z dějů, které vedou k aktivaci ASK1. Cílem této práce byla příprava komplexu katalytické domény ASK1 s proteinem 14-3-3 pro následné studium interakcí těchto dvou proteinů. Oba proteiny byly úspěšně exprimovány v buňkách E. coli a purifikovány. Dále byly připraveny i různé mutantní formy obou těchto...
|
host ::
RSS.